探索新型饲用抗菌肽，助力畜牧业绿色发展

研究发现，Trp富集肽具有抗菌活性高、杀菌速率快、不易产生耐药性等优点，具备替代饲用抗生素的潜质，但在实际应用中其蛋白酶稳定性低这一缺陷降低了口服饲喂的有效性。红心绘梦社会实践队于2025年1月8日在东北农业大学动物科学学院王家俊教授所负责的实验室进行实验，聚焦Trp富集肽这一关键应用技术难题，针对提升Trp富集肽的蛋白酶耐受力进行研究，以期获得具有高蛋白酶稳定性的人工抗酶解型Trp富集肽，有望切实应对病原微生物全球耐药性蔓延以及畜产品药物残留等严峻现状，提高畜产品品质。

实验过程：

抗酶解型Trp富集肽的分子设计及其构效关系研究

（1）抗酶解型Trp富集肽的合成及二级结构测定：多肽在不同环境中的（10 mM PBS、50% TFE、10 mM DPC和10 mM DPG）二级结构采用圆二色谱仪测定。

（2）抗菌活性测定：采用改良微量肉汤稀释法检测抗酶解型Trp富集肽对畜牧业常见病原菌和临床分离耐药菌的最小抑菌浓度，并在此基础上通过涂板法进一步确定其最小杀菌浓度，随后在1×MBC浓度和亚致死浓度下分别测定多肽的杀菌速率和诱导细菌产生耐药的可能性。

（3）协同能力测定：采用棋盘法测定抗酶解型Trp富集肽与青霉素、庆大霉素、氯霉素、头孢他啶、环丙沙星等抗生素的协同抗菌能力。

（4）体外稳定性测定：

①盐离子和血清稳定性：检测抗酶解型Trp富集肽在生理盐离子浓度和血清中的抗菌活性，确定其在生理环境中的稳定性；

②蛋白酶稳定性：抗酶解型Trp富集肽经模拟小鼠胃肠液或10 mg/mL 糜蛋白酶溶液处理后，检测其抗菌活性变化，随后利用SDS-PAGE蛋白胶、圆二色谱仪和液质联用仪进一步分析多肽的分子结构变化，判定其抗酶解能力。

（5）体外生物相容性测定：检测抗酶解型Trp富集肽对小鼠血红细胞的破坏作用，确定其最小溶血浓度，并应用MTT 法检测多肽对猪肠道上皮细胞、猪肾细胞和小鼠肺泡巨噬细胞存活率的影响。
  

目标抗酶解型Trp富集肽的抗菌机制研究

（1）膜作用机制研究：首先，利用BODIPY-TR-cadaverine 染料和大分子互作仪测定LPS/LTA 与目标肽的结合作用，判定目标肽的初始结合靶点。随后，运用荧光探针技术（NPN、DiSC3-5、FITC）、流式细胞仪和脂质体检测目标肽对细菌细胞壁和细胞膜结构的影响。采用扫描电镜、原子力显微镜和透射电镜直接观察经目标肽处理后，细菌菌体表面的形态学改变及其内部超微结构变化。

（2）胞内作用机制研究：细菌经目标肽处理后，运用转录组和iTRAQ 蛋白质组分析技术，寻找与未处理组相比差异显著的基因/蛋白，揭示目标肽诱导细菌凋亡的关键基因/蛋白靶点及其分子机制。

目标抗酶解型Trp富集肽体内活性的研究

（1）体内生物相容性：用不同剂量抗酶解型Trp富集肽、生理盐水（阴性对照）或20 mg/kg蜂毒素（阳性对照）对6周龄ICR小鼠进行腹腔注射给药，每12 h一次，持续3天。随后，所有小鼠麻醉取血，收集血清，分析血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶和血尿素氮的含量，以此判定多肽对小鼠肾脏和肝脏的损伤作用；

（2） 小鼠腹膜炎治疗试验：以6周龄ICR小鼠作为研究对象，腹腔注射接种200 μL的1.5×108 CFU/mL EHEC O157:H7。在感染后0.5 h、2 h、4 h和8 h，用生理盐水（阴性对照）、不同剂量抗酶解型Trp富集肽或5 mg/kg庆大霉素（阳性对照）对小鼠进行腹腔注射给药。24 h后所有存活小鼠麻醉取血，检测全血中菌落数；收集血清，用ELISA法测定血清中TNF-α，IL-6 和IL-1β 水平。随后，向每只小鼠腹腔内注射5 mL无菌生理盐水，采集腹腔液、脾脏和肝脏用于菌落数分析。

此次实践活动，对于参与其中的学生而言，是一次全方位的成长与历练。同学们熟练掌握了圆二色谱仪操作、微量肉汤稀释法等专业实验技能，科研实践能力得到显著提升。从分子设计到体内活性研究的多维度探索，培养了他们系统思考和解决复杂问题的能力。团队成员间的紧密协作，也让大家的团队合作意识愈发强烈。更重要的是，在解决畜牧业实际难题的过程中，学生们深刻领悟到科研的社会价值，进一步激发了对科研事业的热爱与担当。

从科研成果角度来看，此次系列实验收获颇丰，为抗酶解型 Trp 富集肽在畜牧业的应用奠定了坚实基础。未来，该团队计划持续深入研究，进一步优化该肽的性能，探索其大规模应用的可行路径，力求彻底解决畜牧业中病原微生物耐药性和畜产品药物残留问题，为推动畜牧业绿色可持续发展贡献力量。这一研究成果不仅为东北农业大学的科研创新注入新活力，也为整个畜牧业和饲料工业的转型升级提供了强有力的技术支撑，有望引领行业朝着更健康、更绿色的方向迈进。

来源：大学生云报  作者：刘烁 张丽冉 卢晨阳

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